Badania

Metodyka

» Cytometria przepływowa klasyczna i obrazowa

Cytometria przepływowa jest techniką badawczą, umożliwiającą wieloparametrową analizę komórek, w oparciu o ich właściwości morfologiczne oraz fenotypowe. Działanie cytometru opiera się na analizie wyznakowanych fluorescencyjnie obiektów poruszających się jeden za drugim w cienkim strumieniu cieczy, utworzonym dzięki tzw. fokusowaniu hydrodynamicznemu. Obiekty te przechodzą przez wiązki laserów, które wzbudzają obecne na nich fluorochromy. Wyemitowana w ten sposób fluorescencja jest następnie zbierana przez system detektorów i analizowana przez układ elektroniczny. Otrzymane w ten sposób dane prezentowane są w postaci histogramów lub wykresów kropkowych. W ten sposób możemy badać ekspresję zarówno markerów powierzchniowych, jak i wewnątrzkomórkowych, wyznakowanych odpowiednimi przeciwciałami sprzężonymi z fluorochromami. Ponadto, światło laserów rozproszone na analizowanych obiektach daje nam informacje o ich względnej wielkości (parametr forward scatter- FSC),  jak i ziarnistości (parametr side scatter- SSC).

Współczesne kilkulaserowe cytometry przepływowe oraz wciąż poszerzająca się gama barwników fluorescencyjnych, umożliwiają jednoczesną analizę ekspresji kilkunastu antygenów jednocześnie. Ponadto technika ta umożliwia nie tylko analizę, ale również sortowanie wysokooczyszczonych frakcji komórek w oparciu o ich cechy morfologiczne oraz fenotyp (ang. fluorescence -activated cell storting, FACS), także bardzo rzadkich populacji, co jest kluczowe w badaniach nad komórkami macierzystymi.

Należy jednak pamiętać, że w klasycznej cystometrii przepływowej, każdy obiekt reprezentowany jest na wykresie jako punkt. Stąd też w przypadku analizy bardzo małych komórek , np. VSELs, istnieje ryzyko zakwalifikowania szczątków komórkowych czy resztek erytrocytów jako obiektów komórkowych. Aby sprostać tym problemom, stworzono unikatową technologię cystometrii obrazowej- Image Stream (Amnis Corp.). Łączy ona cechy klasycznego cytometru z mikroskopem fluorescencyjnym w jednym urządzeniu, Dzięki temu, oprócz typowej analizy cytometrycznej, uzyskujemy wysokorozdzielcze obrazy każdego analizowanego obiektu w jasnym polu oraz kanałach fluorescencyjnych. Umożliwia to jednoznaczne potwierdzenie czy interesujące nas obiekty są komórkami czy artefaktami.

Cytometria przepływowa jest jednym z naszych głównych narzędzi, wykorzystywanych w badaniach nad komórkami macierzystymi. W naszej Pracowni dysponujemy nowoczesnym, trzylaserowym cytometrem BD Fortessa. Posiadamy także najnowszą generację sortera komórkowego BD FACSAria III, wyposażonego w trzy lasery oraz system odprowadzania aerozoli, umożliwiający sortowanie w standardzie GLP (Good Laboratory Practices). Dysponujemy również możliwością analizy komórek za pomocą cytometru obrazowego Image Stream X.

 

» Metody izolacji komórek

W celu izolacji komórek macierzystych, Zespół Badawczy Laboratorium Biotechnologii Komórek Macierzystych wykorzystuje następujące techniki:

  1. Izolacja mechaniczna (hodowla z eksplantów) - fragmenty tkanki poddawane są mechanicznemu rozdrobnieniu np. skalpelem. Eksplanty pozostawione są na płytce hodowlanej w celu wymigrowania z tkanki komórek i hodowli właściwych komórek w odpowiedniej pożywce hodowlanej.

  1. Izolacja enzymatyczna – fragmenty tkanki poddawane są wstępnemu mechanicznemu rozdrobnieniu, a następnie działaniu enzymów proteolitycznych (np. kolagenazy typu I, kolagenazy typu II, trypsyny) według indywidualnie zoptymalizowanego protokołu badawczego.

  1. Izolacja w oparciu o wirowanie w gradiencie gęstości – metoda umożliwia rozdział składników krwi w zależności od ich gęstości. Do tego celu mogą służyć roztwory hydrofilowych polisacharydów np. fikol, pankol. Podczas wirowania np. pełnej krwi w gradiencie cukrów, w wyniku działania siły odśrodkowej, dochodzi do jej rozdzielenia na poszczególne fazy (frakcje): i) osocze, ii) leukocyty i trombocyty iii) erytrocyty.

  1. Izolacja w oparciu o profil antygenowy - opiera się na wyznakowaniu komórek pochodzących np. z krwi obwodowej lub krwi pępowinowej odpowiednimi przeciwciałami fluorescencyjnymi lub przeciwciałami sprzężonymi z kuleczkami magnetycznymi. Następnie, w zależności od potrzeby, komórki poddawane są izolacji pozytywnej lub negatywnej pod względem obecności określonego antygenu przy wykorzystaniu sortera komórkowego.

» Pozyskiwanie i analiza mikrofragmentów

Pęcherzyki pozakomórkowe (ang. extracellular vesicles) są̨ zróżnicowaną̨ populacją kulistych struktur błonowych uwalnianych zarówno przez komórki eukariotyczne, jak i prokariotyczne, zarówno in vivo, jak i in vitro. Ich obecność stwierdzono w wielu płynach ustrojowych człowieka: krwi, moczu, ślinie, nasieniu, płynie owodniowym oraz w medium kondycjonowanym z hodowli komórek in vitro.  Istnieje kilka metod izolacji pęcherzyków pozakomórkowych, a ich wybór jest ściśle związany z rodzajem materiału biologicznego stanowiącego źródło pęcherzyków. Najbardziej popularną techniką pozyskiwania pęcherzyków pozakomórkowych jest wirowanie sekwencyjne.

W ramach projektów badawczych prowadzonych przez zespół dr hab. Ewy Zuby-Surmy opracowano sposób hodowli linii komórkowych umożliwiający uzyskiwanie pozakomórkowych pęcherzyków błonowych bez kontaminacji pęcherzykami pochodzenia zwierzęcego z surowicy stosowanej do hodowli. Opracowano również metodę izolacji pęcherzyków w oparciu o sekwencyjnie wirowanie nadsączy z hodowli komórkowych. Wśród metod analitycznych wykorzystywanych do scharakteryzowania pęcherzyków znajdują się między innymi mikroskopia sił atomowych (AFM – Atomic Force Microscopy) i NTA (Nanoparticle Tracking Analysis). Wieloparametrowa analiza pęcherzyków pozakomórkowych obejmuje również analizę markerów powierzchniowych z wykorzystaniem cytometrii przepływowej, analizę informacji genetycznej za pomocą PCR w czasie rzeczywistym oraz analizę przenoszenia mRNA i miRNA pęcherzyków do komórek docelowych. W zespole prowadzone są również badania funkcjonalne mające na celu zbadanie, czy i w jaki sposób pęcherzyki mogą oddziaływać z komórkami akceptorowymi.

 

» Inżynieria genetyczna i biologia molekularna

W PRZYGOTOWANIU

» Hodowle komórek pierwotnych

W PRZYGOTOWANIU