Badania

Tematyka Badań

» Identyfikacja i izolacja komórek macierzystych

W naszych badaniach specjalizujemy się w identyfikacji i izolacji różnych populacji komórek macierzystych z materiału pierwotnego, zarówno ludzkiego, jak i zwierzęcego (myszy, szczury). Dysponujemy szeroką wiedzą w zakresie izolacji komórek z krwi obwodowej, krwi pępowinowej, sznura pępowinowego, szpiku kostnego czy tkanek (np. sercowych).

W naszym laboratorium koncentrujemy się na badaniach nad izolacją następujących typów komórek:

  • bardzo małe komórki macierzyste o charakterze embrionalnym  (ang. very small embryonic-like stem cells; VSELs).
  • hematopoetyczne komórki macierzyste (ang. hematopoietic stem cells; HSCs),
  • komórki mezenchymalne (ang. mesenchymal stem cells; MSCs)
  • komórki progenitorowe śródbłonka (ang. epithelial progenitor cells; EPC).

Komórki macierzyste stanowią bardzo niewielką pulę komórek wyjściowych, dlatego też tak ważny jest dobór odpowiednich technik do ich izolacji i identyfikacji. W naszym laboratorium stosujemy zmodyfikowane protokoły, umożliwiające analizę nawet bardzo rzadkich populacji komórkowych, m.in. komórek VSELs. Służy nam do tego głównie klasyczna cytometria przepływowa oraz obrazowa (Image Stream), a także techniki mikroskopowe i molekularne.

Stosowane przez nas metody izolacji komórek macierzystych uzależnione są od typu materiału wyjściowego i populacji, jakie chcemy uzyskać. Przykładowo, zarówno w przypadku szpiku kostnego, jak i krwi, w początkowej fazie izolacji rzadkich populacji nieadherentnych komórek macierzystych, należy pozbyć się erytrocytów. Cel ten osiągnąć można poprzez przyżyciową dla komórek jądrzastych lizę erytrocytów w buforze hipotonicznym lub poprzez wirowanie materiału w gradiencie ficollu. Następnie po uzyskaniu zawiesiny komórek jądrzastych,  sortujemy pożądane populacje komórek. Stosujemy w tym celu dwie strategie sortowania:

  • opartego o kuleczki magnetyczne (ang. magnetic-activated cell storting, MACS)
  • bazującego na znacznikach fluorescencyjnych (ang. fluorescence -activated cell storting, FACS)

W niektórych przypadkach stosujemy dwuetapową strategię pozyskiwania populacji komórek macierzystych, polegającą na wstępnym podczyszczeniu za pomocą MACS, a następnie izolacji czystych populacji za pomocą sortera FACS. Taka procedura izolacji komórek istotnie skraca czas całej preparatyki, zapewniając wysoką czystość otrzymanych frakcji komórkowych.

W przypadku izolacji komórek adherentnych, np. mezenchymalnych komórek macierzystych, metody ich pozyskiwania zależą od typu materiału biologicznego. Na przykład, przy preparatyce szpiku kostnego, należy wysiać go na odpowiednie podłoża, natomiast przy izolacji z tkanek (serce, pępowina), należy je uprzednio rozdrobnić, a następnie podać trawieniu enzymatycznemu. Ważny jest również dobór mediów hodowlanych, promujących przeżycie i proliferację określonych typów komórek.

Identyfikacja populacji komórek macierzystych opiera się głównie o analizę fenotypu komórek i ich cech morfologicznych. Stosujemy w tym celu klasyczną jak i obrazową cytometrię przepływową, a także techniki mikroskopowe. Przykładowo, komórki VSELs można scharakteryzować jako rzadką populację małych (FSClow/SSClow), niehematopoetycznych komórek o fenotypie CD45-/Lin-/Sca-1+ w modelu mysim, natomiast CD45-/Lin-/CD133+ dla materiału ludzkiego (gdzie Lin to mieszanina antygenów charakterystycznych dla dojrzałych komórek hematopoetycznych). Komórki macierzyste charakteryzujemy również w oparciu o ich markery wewnątrzkomórkowe, np. ekspresję czynników transkrypcyjnych Oct-4A i Nanog w komórkach VSELs. Pomocnym narzędziem jest również biologia molekularna, umożliwiająca detekcję ekspresji genów, charakterystycznych dla danej populacji. W identyfikacji określonych typów komórek macierzystych stosuje się również testy funkcjonalne. Na przykład, oprócz fenotypowania,  komórki EPCs można identyfikować w oparciu o test zdolności do pobierania acLDL (ang. acetylated-low density lipoprotein). 

» Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste

Główny nurt zainteresowań zespołu dr hab. Ewy Zuby-Surmy dotyczy wybranych populacji komórek macierzystych. Wśród licznych modeli badawczych znajdują się wyprowadzone w naszym laboratorium mysie oraz ludzkie linie indukowanych komórek macierzystych pluripotentnych tzw. komórek iPS (ang. induced Pluripotent Stem cells – iPSc). Komórki iPS są przykładem komórek zdolnych do różnicowania się we wszystkie typy komórek budujących organizm ssaka. Są otrzymywane z dojrzałych komórek organizmu w wyniku procesu określanego, jako reprogramowanie genetyczne. Dokonuje się tego zazwyczaj poprzez wprowadzenie do komórek somatycznych genów kodujących czynniki transkrypcyjne Oct4, Sox2, Klf4 oraz Myc, co nazywane jest także transdukcją OSKM.

Komórki iPS stanowią kluczowy materiał badawczy w projekcie finansowanym w ramach programu Team (FNP) pt. „Bioaktywne mikrofragmenty pozyskiwane z komórek macierzystych, jako nowe narzędzie w regeneracji tkanek". Do otrzymania komórek iPS użyto bezpieczne, nieintegracyjne metody transdukcji, które mogą być przydatne do aplikacji w medycynie regeneracyjnej. W prowadzonych pracach doświadczalnych in vitro stosujemy specjalistyczne protokoły hodowli komórek, narzędzia do ich identyfikacji, charakteryzacji oraz modyfikacji na poziomie genetycznym. Na podkreślenie zasługuje fakt, że hodowla komórek iPS w naszym laboratorium jest prowadzona bez warstwy odżywczej fibroblastów i w pożywce bezsurowiczej, co wyklucza izolację mikrofragmentów pochodzących z innego źródła, niż komórki iPS. Pozyskane bioaktywne pochodne komórek iPS są badane przez zespół pod kątem wykorzystania, jako naturalnych nośników bioaktywnych związków w terapii tkanek uszkodzonych w wyniku ischemii, w tym niedotlenionego mięśnia sercowego. Inny ważny aspekt stanowi potencjalne wykorzystanie preparatów mikrofragmentów w celu wzmocnienia potencjału regeneracyjnego innych komórek stosowanych w terapiach eksperymentalnych.

» Komórki antygenowo zdefiniowane

W PRZYGOTOWANIU

» Mikrofragmenty

W literaturze obok klasycznie rozumianego oddziaływania parakrynnego pojawia się oddziaływanie będące jego odmianą, uwzględniające sekrecję oraz ponowne wykorzystanie błonowych pęcherzyków pozakomórkowych (ang. extracellular vesicles, EVs). Pęcherzyki pozakomórkowe są kulistymi strukturami, w których fragment cytoplazmy komórkowej jest otoczony błoną komórkową. Ich uwalnianie jest zjawiskiem fizjologicznym, towarzyszącym proliferacji, różnicowaniu i starzeniu się komórek oraz ich aktywacji w procesach, takich jak na przykład niedotlenienie tkanek czy ich uszkodzenie. Komórki eukariotyczne wydzielają różne typy pęcherzyków pozakomórkowych, między innymi mikropęcherzyki (ang. microvesicles, MVs) i egzosomy. Mikropęcherzyki, inaczej mikrofragmenty błonowe lub ektosomy, są złuszczane z powierzchni błony cytoplazmatycznej w procesie jej odpączkowywania. Egzosomy to sferyczne fragmenty błon wewnątrzkomórkowych uwalniane przez późne endosomy (ang. multivesicular bodies, MVBs). Powszechnie, jako kryterium odróżniające egzosomy od mikropęcherzyków przyjmuje się ich wielkość (do 100 nm) oraz obecność charakterystycznych markerów np. tetraspanin (CD9, CD63, CD81), białek TSG101 i Alix. Mikropęcherzyki to struktury większe niż 100 nm, a mniejsze niż 1000 nm, dla których nie opisano charakterystycznych markerów.

Ostatnie doniesienia wskazują na obecność receptorów komórkowych, białek cytoplazmatycznych i informacji genetycznej (DNA, mRNA, miRNA) w pęcherzykach pozakomórkowych i możliwość modyfikacji fenotypu komórek znajdujących się w tkankach poprzez przeniesienie wspomnianych bioaktywnych cząsteczek za pomocą wymiany pęcherzyków pozakomórkowych.

 

Polecana literatura:

Wójtowicz i inni, Charakterystyka i znaczenie biologiczne mikropęcherzyków błonowych, Postępy Hig Med Dośw (online), 2014; 68:1421-1432

» Modyfikacje genetyczne komórek

W PRZYGOTOWANIU

» Komórki macierzyte w badaniach klinicznych

W ramach naszych badań, we współpracy z ośrodkami klinicznymi w Polsce, badamy mechanizmy mobilizacji komórek macierzystych do krwi obwodowej u pacjentów cierpiących głównie na schorzenia układu krążenia.

W warunkach homeostazy, w krwi obwodowej człowieka krąży niewielka pula różnych populacji komórek macierzystych, takich jak:

  • hematopoetyczne komórki macierzyste, (ang. hematopoietic stem cells; HSC),
  • macierzyste komórki mezenchymalne (ang. mesenchymal stem cells; MSC),
  • komórki progenitorowe śródbłonka (ang. epithelial progenitor cells; EPC),
  • bardzo małe komórki macierzyste (ang. very small embryonic-like stem cells; VSEL)

Wiele prac ukazuje, że czynniki stresogenne, takie jak uszkodzenie tkanek, niedotlenienie czy odpowiedź zapalna, mogą powodować wyrzut tych komórek z ich naturalnej niszy- szpiku kostnego, do krwi obwodowej. Postuluje się, że komórki te krążąc w krwiobiegu, mogą zostać „zwabione" do miejsca uszkodzenia poprzez czynniki chemotaktyczne wydzielane przez niedotlenioną tkankę, np. SDF-1 (ang. stromal-derived factor-1). W ten sposób zmobilizowane komórki macierzyste mogą przyczyniać się do mechanizmów naprawczych w wyniku ich proliferacji i różnicowania lub, bardziej prawdopodobnie, w sposób pośredni poprzez wydzielanie czynników parakrynnych, stymulujących rezydujące komórki do regeneracji miejsca uszkodzenia.

W naszych badaniach, w celu określenia kinetyki mobilizacji komórek macierzystych, koncentrujemy się na analizie cytometrycznej próbek krwi, pobieranych w różnych punktach czasowych od pacjentów:

  • z wadami serca operowanych z krążeniem pozaustrojowym (dzieci)
  • z migotaniem przedsionków poddanych ultradźwiękowej ablacji
  • z chorobą wieńcową/ wadą zastawki operowanych z krążeniem pozaustrojowym

Ponadto korelujemy otrzymane wyniki z parametrami klinicznymi pacjentów. Badamy także profil cytokin prozapalnych i angiogennych: ilościowo (Milliplex, Millipore) oraz półilościowo (Proteome Profiler Arrays, R&D), obecnych w osoczu pacjentów. Analizujemy także zmiany ekspresji genów (qPCR), charakterystycznych dla poszczególnych komórek macierzystych i progenitorowych.

Współpracujemy także w ramach próby klinicznej REGENT VSEL, w której  pacjenci z chorobą niedokrwienną serca leczeni są za pomocą autologicznych komórek macierzystych izolowanych ze szpiku kostnego. W obrębie tej współpracy analizujemy materiał transplantacyjny pod kątem jego żywotności, zawartości komórek macierzystych oraz obecności czynników bioaktywnych (mikrofragmenty, cytokiny), mogących stymulować procesy naprawcze.

Nasze badania mają na celu przybliżenie i zrozumienie mechanizmów mobilizacji komórek macierzystych w różnych stanach patologicznych oraz ich roli w procesie regeneracji tkanek. Mamy nadzieję, że zdobyta przez nas wiedza pozwoli w przyszłości stworzyć nowe strategie terapeutyczne lub udoskonalić obecnie stosowane.

 

» Udział w badaniach klinicznych

W PRZYGOTOWANIU